細胞内の複数のマイクロRNAを同時に検知して 細胞を生きたまま精密に分けることに成功
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ポイント
メッセンジャーRNA（mRNA）注１）を細胞内に導入することで、一度に複数の細胞内マイクロRNA（miRNA）注２）を検知し、生きた細胞で多変量解析注３）を実行することができた。
細胞によって発現量が異なる複数のmiRNAを同時に検出することで、細胞の種類や分化段階に応じて細胞を分画することに成功した。
要旨
遠藤慧助教（東京大学大学院新領域創成科学研究科）、齊藤博英教授（京都大学CiRA未来生命科学開拓部門）らの研究グループは、人工RNAを細胞に導入することで、生きた細胞内の複数のマイクロRNA（miRNA）を検知して、細胞の種類に応じて精密に分画することに成功しました。これにより、特定の種類の細胞を生きたまま検知することが可能になり、将来的には標的細胞の純化に用いるなど、医療応用に貢献できると期待されます。
この研究成果は2019年8月22日午前4時（日本時間）に米国科学誌「Science Advances」でオンライン公開されました。
研究の背景
iPS細胞を用いた再生医療や薬剤スクリーニングを行うには、iPS細胞を目的の細胞に分化させることが必要です。しかし、必ずしもすべてのiPS細胞が目的の細胞に分化するわけではなく、未分化の細胞や目的と異なる細胞が混じっています。このような細胞集団は、細胞種によって異なる細胞表面の抗原を抗体で検出することで分画する（分ける）ことが可能ですが、最適な表面抗原が同定されていない細胞種も多くあります。
そこで研究グループは、細胞内のmiRNAに着目し、細胞種に特異的なmiRNAを識別する人工RNAの開発に取り組んできました。人工RNAは、細胞内に導入しても一定時間後に消失する点や、細胞内の状態を生きたまま検出できる点が、医療応用における利点であると考えられています。同グループはこれまでに、細胞内の1種類のmiRNAを識別し、細胞運命を制御する回路（参考：CiRA HP 研究成果 2015年8月4日「細胞の機能を精密に制御する人工回路をRNAで構築： ヒトの細胞で成功」 https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/pressrelease/news/150804-110938.html）や、2種類のmiRNAの有無によって論理演算を行い、任意のタンパク質の発現を制御する回路（参考：CiRA HP 研究成果 2018年11月20日「人工RNA論理回路で細胞の運命を制御する」 https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/pressrelease/news/181120-000000.html）を人工RNA上に実現してきました。本研究ではさらに、複数種類のmiRNAの発現量を同時に検知して、生きた細胞のまま多変量解析を行い、細胞の状態を定量的に算出できる人工mRNAの開発に取り組みました。
研究結果
１）生細胞内で多変量解析を実行するmRNAの設計
研究グループはまず、1本のmRNAによって複数のmiRNAを検知することを試みました。mRNAの5’非翻訳領域注４）に、目的のmiRNAに相補的注５）な配列を入れる5つのスロット（任意の配列を挿入できる位置）と蛍光タンパク質の配列を挿入し、細胞内のmiRNAが結合すると蛍光タンパク質の発現が低下するようなmRNAを作製しました（図1）。
図1 複数のmiRNAを検知する人工mRNAの構造。slot…miRNAに相補的な配列を入れる部分、AUG…開始コドン注６）
このmRNAのスロットに、HeLa細胞注７）において発現している複数のmiRNAに相補的な配列を挿入し、HeLa細胞に導入しました。導入する際、それぞれのmiRNAの阻害剤を同時に細胞内に入れ、人工RNAにmiRNAが結合していない場合と、1つのmiRNAのみが結合している場合、および複数のmiRNAが結合している場合での蛍光タンパク質の発現量を比較しました。
その結果、複数のmiRNAが同時に作用する場合、その活性はそれぞれのmiRNAの活性の乗算値と近い数字になることが明らかになりました。例えば、2種類のmiRNA（miR-17-5pおよびmiR-92a-3p）を検知する人工mRNAにおいて、両者のmiRNAに対する阻害剤を導入した場合の蛍光タンパク質の発現量を1とすると、miR-17-5pまたはmiR-92a-3pだけを阻害した場合の発現量はそれぞれ0.78、0.84でした。さらに、阻害剤を導入しなかった場合（両者のmiRNAの活性が阻害されていない場合）には、蛍光タンパク質の発現量は0.67となり、これは、一方のmiRNAのみを阻害した場合の発現量の乗算値（0.78×0.84＝0.66）とほぼ一致しました（図2A）。同様に、検知するmiRNAの数と組み合わせが異なる12通りの実験を行ったところ、1種類のmiRNAのみを検出した際の数値から試算した値と、実際に複数のmiRNAを検知した場合の蛍光タンパク質の発現量はどの組み合わせでもほぼ一致しました（図2B）。
図2 A：2種類のmiRNA相補的配列をもつ人工mRNAの構造と蛍光タンパク質の相対的発現量
B：複数種類のmiRNAを同時に検知した場合の蛍光タンパク質の発現量（横軸）
および1種類のmiRNAを検知した場合の発現量に基づく試算値（縦軸）
２）ターゲット配列を入れるスロットの位置による蛍光タンパク質の発現量の変化
１）の実験によって、研究グループは、同じmiRNAを検知する場合であっても、相補的な配列がどのスロットにあるかによって、蛍光タンパク質の発現を阻害する度合いが異なることに気付きました。そこで、相補的な配列の位置が蛍光タンパク質の発現にどのように影響するのかを調べるため、同じ配列を複数、異なるスロットに入れた人工mRNAを作成しました。１）の実験から、人工mRNA上の5つのスロットのうち1つにmiRNA相補的配列を入れた場合の蛍光タンパク質発現の相対値をρとすると、この人工mRNAからの蛍光タンパク質の発現量は、ρの乗算と試算されます（図3A）。4種類のmiRNAについて、試算値と実際の測定値から、測定値を精度よく予測できる各スロットのρを算出できました（図3B）。すると、スロットの位置と発現量には明確な相関関係があり、開始コドンからの距離が大きいほど、発現を抑制する度合いは小さいことがわかりました（図3C）。
図3 A：人工mRNA上のターゲット配列の位置の模式図。赤色がターゲット配列の入ったスロットを示す。
B：同じターゲット配列を複数入れた人工mRNAを細胞内に導入した場合の蛍光タンパク質の
相対的発現量の予測値（縦軸）および実測値（横軸）。
C：ターゲット配列を入れるスロットの位置（横軸）と蛍光タンパク質の発現を抑制する度合い（縦軸）。
３）生細胞内多変量解析に基づく細胞の分画
続いて、１）、２）の実験をもとに、異なる種類の細胞や、iPS細胞から分化している途中の段階の細胞を、細胞内のmiRNAに基づいて分画することを試みました。まず、細胞内の状態によって特徴的なmiRNAを検知できるよう、シミュレーションに基づいて4種類の人工mRNAを設計しました（図4A）。mRNAは、それぞれが異なる組み合わせのmiRNAを検知し、異なる蛍光タンパク質を発現するよう設計されており、蛍光の強さの比によって細胞を分画できると予測しました（図4B）。実際に、設計した人工RNAをそれぞれの細胞に導入したところ、細胞ごとの蛍光強度の比は、シミュレーションに近い値を示しました（図4C）。
これらの実験から、生きた細胞を用いて多変量解析を実現することに初めて成功するとともに、iPS細胞を含む異なる細胞集団を生きたまま精密に分画することができました。複数のmiRNAの活性を同時に検出することで、iPS細胞の分化の過程を精密に識別することにも成功しました。
図4 A：4種類の人工RNAの模式図。スロット内の文字はターゲット配列を示し、hmAG1、hmKO2、tagBFP、hdKRedは蛍光タンパク質の種類を示す。
B：蛍光強度の比による細胞分画のシミュレーション。NHDF…ヒト皮膚線維芽細胞、NHLF…ヒト肺線維芽細胞、NHEK…ヒト新生児角化細胞、
HRE…ヒト腎臓上皮細胞、MEF…マウス胎児線維芽細胞、HeLa…HeLa細胞、hiPSC…ヒトiPS細胞、hiPSC (14d w/o bFGF)…増殖因子を除いた
培地で14日間培養したヒトiPS細胞
C：実際に人工RNAをそれぞれの細胞に導入した場合の蛍光強度の比。赤字は細胞の種類を示し、赤い分画はその種類の細胞を示す。
本研究の意義と今後の展望
従来、細胞内の複数の要素に基づく多変量解析は、細胞を破壊し、その内容物を抽出しなければ行うことができませんでした。一方、本研究では、mRNAを導入することで、細胞内の複数のmiRNAの活性に基づき、細胞を生かしたまま多変量解析を行うことを実現しました。また、この解析によって、細胞集団を細胞の種類や分化段階に応じて分画することに成功しました。
今後は、分画の精度をさらに向上させ、純度の高い細胞集団を作り出すことで、再生医療に用いる分化細胞を精密に分画するなどの医療応用への貢献が期待されます。
論文名と著者
○ 論文名
“Numerical operations in living cells by programmable RNA devices”
ジャーナル名
Science Advances
著者
Kei Endo1,2*, Karin Hayashi1, and Hirohide Saito1*
著者の所属機関
1.京都大学 iPS細胞研究所（CiRA）
2.東京大学大学院新領域創成科学研究科
*:責任著者
本研究への支援
本研究は、下記機関より支援を受けて実施されました。
日本学術振興会（JSPS）科学研究費助成事業（科研費）基盤研究(S)、若手研究 (B)
内藤記念科学振興財団
日本医療研究開発機構（AMED）再生医療実現拠点ネットワークプログラム
用語説明
注１）メッセンジャーRNA（mRNA）
DNA上の遺伝子情報はmRNAに転写された後、mRNAから読み取られた情報をもとにタンパク質が合成され（翻訳され）、細胞内で機能する。
注２）マイクロRNA（miRNA）
マイクロRNAのこと。20?30塩基程度の長さの短いノンコーディング（タンパク質をコードしていない）RNA。相補的な配列を持つmRNAと結合して翻訳を抑制したり、mRNAを分解したりすることで、そのmRNAからのタンパク質の合成を抑制する働きをもつと考えられている。
注３）多変量解析
複数の変数を統計的に処理する手法のこと。ここでは、細胞内の複数のmiRNAを同時に検知し、それぞれの活性に基づいて細胞種を特定すること。
注４）5’非翻訳領域
mRNAにおいて、タンパク質に翻訳されない領域。翻訳が始まる部分（開始コドン）の上流にある。
注５）相補的
DNAやRNAの特定の配列に結合する配列を持っていること。
注６）開始コドン
mRNAの情報をもとにタンパク質を合成するとき、情報の読み取り（翻訳）を始める位置。
注７）HeLa細胞
ヒト由来の最初の細胞株。ヒト子宮頸がんから分離され、株化された。